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大熊貓糞便中線粒體基因庫(kù)特點(diǎn)研究

李曉達(dá)1#，任曉彤1,2#，高雨薇1，王文慧1，張  琦1，褚佳寧1，林立鈞3，徐艷春1，楊淑慧1*

（1. 東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱，150040；2. 菏澤市疾病預(yù)防控制中心，菏澤，274000；3. 東北林業(yè)大學(xué)奧林學(xué)院，哈爾濱，150040）

論文摘要

為了解大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）腸道脫落細(xì)胞中線粒體DNA（mtDNA）的異質(zhì)性特點(diǎn)及其與年齡的關(guān)系，以92只不同年齡的大熊貓糞便為材料，通過(guò)擴(kuò)增子高通量測(cè)序研究非編碼的D-loop區(qū)、編碼rRNA的16S rRNA區(qū)以及編碼蛋白質(zhì)的ND1和ND2區(qū)的異質(zhì)性。結(jié)果顯示：D-loop區(qū)存在3個(gè)異質(zhì)性熱點(diǎn)區(qū)段，突變堿基的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他3個(gè)編碼區(qū)；D-loop區(qū)TS/TV小于16S rRNA和ND兩個(gè)編碼區(qū)，表明后兩者較D-loop區(qū)受到更強(qiáng)烈的純化選擇；ND區(qū)第3位密碼子的突變頻率顯著高于前兩位，選擇壓力最低。此外，16SA3、ND1A6和ND2A7三個(gè)編碼區(qū)的異質(zhì)性可能與年齡相關(guān)。上述結(jié)果表明，大熊貓糞便DNA的異質(zhì)性突變構(gòu)成了一個(gè)多樣性較高的線粒體基因庫(kù)，突變?cè)诮M織細(xì)胞水平上受到自然選擇的作用。該線粒體基因庫(kù)為揭示動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制、個(gè)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)方式、個(gè)體適合度和動(dòng)物與腸道微生物及環(huán)境的關(guān)系等提供一個(gè)全新的角度，也可能成為有潛力的大熊貓個(gè)體年齡預(yù)測(cè)標(biāo)記。

論文速覽

線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器之一，由原始真核細(xì)胞內(nèi)共生的好氧菌進(jìn)化而來(lái)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)能量代謝、Ca2 緩沖和細(xì)胞的程序性死亡等具有至關(guān)重要的作用。它是一個(gè)由內(nèi)外雙層膜圍成的細(xì)胞器，擁有獨(dú)立于核基因組的環(huán)狀基因組，即線粒體基因組（mitochondrial genome, mtgenome），也稱線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA)。在哺乳動(dòng)物中，mtDNA長(zhǎng)約16.5 kb，包括1個(gè)控制區(qū)（D-loop區(qū)）和37個(gè)基因，編碼22種tRNAs、2種rRNA和13個(gè)電子傳遞鏈的蛋白亞基和ATP合成酶的2個(gè)亞基。雖然這些基因編碼的蛋白質(zhì)大約只占線粒體蛋白質(zhì)總量的1%，但對(duì)線粒體氧化磷酸化和細(xì)胞能量轉(zhuǎn)化是必不可少的。

大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）是舉世矚目的明星物種，經(jīng)過(guò)半個(gè)多世紀(jì)的努力，種群得到顯著恢復(fù)，已從瀕危（EN）轉(zhuǎn)為易危（VU）。但是，圍繞大熊貓這一生物學(xué)特性非常明顯的物種開展的科學(xué)研究繼續(xù)向著縱深發(fā)展，如組裝了大熊貓高質(zhì)量的參考基因組，揭示了其演化與亞種分化歷史、低代謝率的適應(yīng)機(jī)制、特殊食性的進(jìn)化機(jī)制，以及代謝組學(xué)和脂肪組學(xué)特性所反映的適應(yīng)機(jī)制等。線粒體基因庫(kù)又提供了一個(gè)新的角度來(lái)探究大熊貓生理、發(fā)育、衰老和適應(yīng)背后的基因組學(xué)機(jī)理，為進(jìn)一步保護(hù)大熊貓?zhí)峁┬碌目茖W(xué)依據(jù)。

大熊貓糞便是最易得的材料之一，可通過(guò)糞便獲得大熊貓腸道上皮脫落的細(xì)胞DNA。這些腸道上皮細(xì)胞主要來(lái)自大腸，包括大腸上皮中吸收性上皮細(xì)胞、分泌性杯狀細(xì)胞和腸內(nèi)分泌細(xì)胞等。腸上皮細(xì)胞的更新速度極快，3~5 d就會(huì)完全更新一次。海量的細(xì)胞增殖也伴隨著線粒體及其基因組的海量增殖，所產(chǎn)生的突變均累積在子代上皮細(xì)胞中。這些子代細(xì)胞完成使命后脫落到腸腔，隨糞便排出體外。有研究表明，小鼠每24 h脫落的腸上皮細(xì)胞數(shù)可達(dá)2×1011個(gè)。所以，利用糞便中數(shù)量龐大的腸道上皮細(xì)胞，足以精準(zhǔn)檢測(cè)和研究mtDNA的異質(zhì)性。本研究利用92只大熊貓的糞便DNA，通過(guò)PCR和擴(kuò)增子高通量測(cè)序方法，研究其腸道上皮組織中mtDNA D-loop區(qū)異質(zhì)性的空間分布特點(diǎn)，初步揭示這一區(qū)段突變和選擇的特點(diǎn)，為深化對(duì)線粒體基因庫(kù)的認(rèn)識(shí)提供資料。

● 大熊貓mtDNA四個(gè)區(qū)域異質(zhì)性突變轉(zhuǎn)換與顛換比（Ts/Tv）的頻率分布

● ND1和ND2蛋白質(zhì)編碼區(qū)不同密碼子異質(zhì)性突變頻率的分布

● 大熊貓糞便mtDNA 五個(gè)區(qū)段異質(zhì)性（HP）的空間分布格局

● 大熊貓糞便mtDNA異質(zhì)性隨著月齡的分布

● 大熊貓糞便mtDNA異質(zhì)性與月齡的關(guān)系

研究表明：

1. 從整個(gè)群體的線粒體基因組來(lái)看，非編碼區(qū)的D-loopA1和D-loopA2區(qū)段每個(gè)個(gè)體平均異質(zhì)性位點(diǎn)數(shù)分別為（149.0 ± 43.1）個(gè)和（92.9 ± 60.0）個(gè)，遠(yuǎn)高于其他3個(gè)編碼區(qū)段[（3.2 ± 3.8）~（5.2 ± 7.2）個(gè)]。D-loopA1和D-loopA2區(qū)段每個(gè)個(gè)體平均異質(zhì)性頻率分別為（0.015 ± 0.006）和（0.071 ± 0.030），也高于其他3個(gè)區(qū)段。D-loopA1的異質(zhì)性位點(diǎn)分布于第50~330位堿基，而D-loopA2明顯分為2個(gè)熱點(diǎn)區(qū)段，一是第700 ~ 850位堿基，二是第860~1100堿基續(xù)位，前者異質(zhì)性頻率較低，后者頻率較高。

2. 從5個(gè)區(qū)段的整體來(lái)看，個(gè)體上檢測(cè)到的轉(zhuǎn)換（TS）為8~425個(gè)，平均為（164.7 ± 74.1）個(gè)；顛換（TV）為20~384個(gè)，平均為（202.6 ± 70.7）個(gè)；TS/TV為0.400~1.107，平均為（0.786 ± 0.136）。各區(qū)段上的TS/TV變化較大，如D-loopA1區(qū)TS/TV為0.267 ~ 0.897，平均為0.706，而D-loopA2區(qū)TS/TV為0.385 ~ 2.250，平均值為0.979，說(shuō)明D-loop區(qū)受到正選擇和中性選擇。相比而言，其他編碼區(qū)更傾向于純化選擇（亦稱負(fù)選擇），如16SA3區(qū)域TS/TV為0.333 ~ 19.000，平均值為3.638，ND1與ND2區(qū)域TS/TV為0~9.000，平均值為1.671。

3. 將ND1和ND2兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)域按照密碼子C1、C2和C3分別計(jì)算異質(zhì)性突變頻率并進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，ND1A6區(qū)域上3個(gè)密碼子之間都存在極顯著差異（C1 vs. C2: P = 0.008；C1 vs. C3: P < 0.001；C2 vs. C3: P < 0.001）；同樣，ND2A7區(qū)域也顯示相同的差異性，3對(duì)比較的P值均< 0.001。

4. 5個(gè)區(qū)域作為整體（Total）來(lái)看，點(diǎn)的分布沒有顯示出顯著的傾向性，而是以圍繞質(zhì)心向四周發(fā)散。把異質(zhì)性堿基中的轉(zhuǎn)換和顛換分別提取出來(lái)，也同樣沒有顯著的傾向性分布。單獨(dú)計(jì)算各個(gè)區(qū)段，發(fā)現(xiàn)D-loop區(qū)的2個(gè)區(qū)域沒有傾向性分布，但編碼區(qū)16SA3、ND1A6和ND2A7三個(gè)區(qū)域的異質(zhì)性堿基數(shù)量分布出現(xiàn)一定的傾向性，預(yù)示其與年齡可能存在一定的關(guān)系。

5. 5個(gè)區(qū)域總的異質(zhì)性堿基數(shù)在雌性之間存在顯著差異（P = 0.020）。在分區(qū)域比較時(shí)，D-loopA1、16SA3、ND1A6和ND2A7均無(wú)顯著差異（P分別為0.318、0.647、0.510、0.765），只在D-loopA2存在顯著差異（P = 0.024）。按性別分組，把每組樣本再按年齡從小到大排列制作折現(xiàn)圖，觀察異質(zhì)性堿基數(shù)的分布情況。發(fā)現(xiàn)5個(gè)區(qū)域的整體和D-loopA2的性別差異可能受極端值的影響所致。把此值去除后，P值分別增加到0.040，差異的顯著性明顯下降。因此，總體上可以認(rèn)為異質(zhì)性在性別之間沒有顯著差異。

上述結(jié)果表明，大熊貓糞便DNA的異質(zhì)性突變構(gòu)成了一個(gè)多樣性較高的線粒體基因庫(kù)，突變?cè)诮M織細(xì)胞水平上受到自然選擇的作用。該線粒體基因庫(kù)為揭示動(dòng)物適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制、個(gè)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)方式、個(gè)體適合度和動(dòng)物與腸道微生物及環(huán)境的關(guān)系等提供一個(gè)全新的角度，也可能成為有潛力的大熊貓個(gè)體年齡預(yù)測(cè)標(biāo)記。

● 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32170517）；大熊貓國(guó)家公園珍稀動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目（KLSFGAGP2020.017）

● 第一作者簡(jiǎn)介：李曉達(dá)（1999—），男，碩士研究生；主要從事保護(hù)遺傳學(xué)研究。E-mail：925194078@qq.com

● #共同第一作者：李曉達(dá)；任曉彤

● *通信作者：楊淑慧，E-mail：4745682512@qq.com